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  Récepteurs membranaires
 

Récepteurs membranaires : point de mire des médicaments - 26/05/2008

Ralf Jockers:

Grâce aux énormes progrès de la biologie depuis la deuxième moitié du 20ième siècle, la recherche biomédicale permet un traitement de plus en plus adapté des malades. Dans ce contexte, l'identification de nouveaux médicaments mieux ciblès constitue un élément clè. Notre équipe s'engage dans cette identification et s'attache à comprendre les effets à court et à long terme des médicaments. Nous découvrirons la méthodologie Bret, les récepteurs couplés aux protéines G,....

Les récepteurs membranaires exprimés à la surface des cellules sont les principaux relais entre l’environnement extérieur et l’intérieur de la cellule.

L’activation de ces récepteurs par des hormones spécifiques constitue la première étape d’une cascade d'événements aboutissant aux effets biologiques des hormones.

En même temps, ces récepteurs sont des cibles majeures des médicaments. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), par exemple, constituent actuellement quantitativement la plus importante cible des médicaments utilisés de nos jours.

Nous avons choisi de travailler sur deux familles de récepteurs membranaires, les RCPG et les récepteurs aux cytokines pour mieux comprendre leur fonctionnement, l’action des médicaments sur ces récepteurs et leurs rôles dans diverses maladies.

Au cours de l’année 1999, une nouvelle technique, représentant une avancée considérable pour l’étude des interactions protéine-protéine, a été mise au point : la technique de BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer).

Cette technique est dérivée d’un processus biologique naturel, existant dans un organisme marin, chez lequel l’énergie émise par une luciférase excitée est transmise à une GFP (Green Fluorescence Protein) qui émet alors de la lumière à une autre longueur d’onde. Dans la technique de BRET, la luciférase de Renilla est fusionnée à une protéine d’intérêt (protéine A).

La GFP est fusionnée à l’autre protéine d’intérêt (protéine B), susceptible d’interagir avec la protéine B. La luciférase est excitée à l’aide d’un substrat qui pénètre dans la cellule (cœlenterazine). Si les deux protéines n’interagissent pas, on ne détecte que le signal émis par la luciférase à 480 nm.

 

Si les deux protéines interagissent, il y a transfert d’énergie entre la luciférase et la GFP et l’on peut mesurer un signal supplémentaire émis par la GFP à 530 nm. Le transfert d’énergie reflète une interaction physique étroite : pour qu’il y ait transfert d’énergie, la distance entre la luciférase et la GFP doit être inférieure à 100 Å.

Les récentes données du séquençagegénome humain ont révélé l’existence d’environ 750 gènes codant pour des RCPG à 7 domaines transmembranaires. Ces récepteurs sont impliqués dans la plupart des processus physiologiques et leur dysfonctionnement ou leur absence est à l’origine de nombreuses maladies. Typiquement, ces récepteurs transmettent les signaux de l’environnement extérieur à l’intérieur de la cellule en activant des protéinesenzymes, canaux ioniques). du G hétérotrimériques. Celles-ci une fois activées transmettent leur signal à des effecteurs (

Notre modèle d’étude, les récepteurs de la mélatonine (MTR), font partie de la super famille des RCPG. Chez l’homme, trois récepteurs appartenant à la sous-famille des MTR, appelés MT1, MT2 et GPR50, ont été clonés. Leur ligand, la mélatonine, est impliquée dans toute une série de processus physiologiques comme le rythme circadien, le cycle de reproduction saisonnier, le sommeil, mais très probablement aussi dans le cancer, des désordres mentaux et les maladies neuro-dégénératives. Cette hormone, sécrétée par la glande pinéale de façon circadienne, avec un pic de concentration pendant la nuit, cible les récepteurs MT1 et MT2. En revanche, GPR50 est insensible à la mélatonine et fait partie des RCPG orphelins (sans ligand connu).

1- L’oligomérisation des MTR

La plupart des membres de la famille des RCPG peuvent former des homo- et des hétérodimères avec des conséquences fonctionnelles importantes pour leur pharmacologie, leur signalisation et leur régulation. Les MTR n’y font pas exception ! L’équipe utilise la technique de BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) et des méthodes biochimiques pour étudier l’oligomérisation et sa relation avec l’état d’activation des récepteurs.

A) L’hétérodimérisation du récepteur MT1 et de GPR50

Malgré les efforts intenses de la recherche industrielle et académique pour trouver un ligand pour chacun des 380 RCPGs non-olphactifs, plus de 140 récepteurs restent encore orphelins sans ligand). La compréhension de la fonction de ces récepteurs orphelins reste un défi majeur puisque ces récepteurs sont la cible privilégiée de nombreuses drogues.

Nous avons montré que le récepteur orphelin GPR50 hétérodimérise constitutivement avec le récepteur MT1. De façon intéressante, l’engagement du récepteur orphelin GPR50 au sein de l’hétérodimère avec MT1 liant la mélatonine, a de profondes conséquences sur la fonction de MT1, à savoir l’inhibition des sites de liaison de haute affinité pour l’agoniste, le couplage des protéines G hétérotrimériques et la fixation des β-arrestines. Une analyse plus détaillée a montré que la  longue extrémité C-terminale de GPR50 prévient le recrutement de partenaires d’interaction intracellulaires au sein de l’hétérodimère.

La pertinence de l’effet inhibiteur de GPR50 sur la fonction de MT1 a été confirmée par les résultats obtenus dans les cellules endothéliales cérébrales humaines hCMEC/D3 récemment immortalisées. L’extinction par siRNA du messager codant pour GPR50 a révélé que les niveaux d’expression endogènes de GPR50 étaient suffisants pour abolir toute activité du récepteur MT1.

2 - Les partenaires d’interaction des MTR

Afin de mieux comprendre la régulation et les voies de signalisation liées aux récepteurs MT1 et MT2 (MTR) et d'identifier d'éventuelles cibles pharmacologiques, trois approches ont été développées dans l'équipe pour l'identification et la caractérisation des partenaires protéiques interagissant avec ces récepteurs. A une approche initiale de criblage par double hybride dans la levure en collaboration avec la société Hybrigenics (Paris) sont venues s'ajouter deux approches protéomiques complémentaires : la purification des complexes protéiques associés aux MTR exprimés en lignée cellulaire par Tandem Affinity Purification (TAP) et la purification de protéines de lysats de cerveaux de souris interagissant avec la queue C-terminale des MTR par chromatographie d'affinité. Pour ces deux dernières techniques, les protéines éluées de la matrice d'affinité sont séparées par électrophorèse mono- ou bi-dimensionnelle et analysées par spectrométrie de masse.

Approche à partir de la queue cytoplasmique du récepteur : Cette approche est basée sur l'interaction de protéines issues de lysats de cerveaux de souris avec la queue cytoplasmique des MTR immobilisée sur une matrice. Une étiquette poly-histidine placée à l'extrémité N-terminale du peptide permet son immobilisation sur des billes recouvertes de nickel.

Approche à partir du récepteur entier (TAP) : La technique de purification par TAP repose sur la fusion du récepteur "entier" avec une étiquette portant deux modules d'affinité séparés par un site de clivage par une protéase spécifique. Cette méthode permet d'effectuer une purification de complexes protéiques en condition native. Les modules choisis sont un couple de domaines de liaison aux IgG et un domaine de liaison à la calmoduline.

3 -  La famille des MTR et les désordres mentaux

Bien que des avancées importantes aient été enregistrées dans le domaine de la dépression, les bases moléculaires de celle-ci restent largement incomprises. Il est urgent de trouver des antidépresseurs plus efficaces et mieux tolérés pour ces maladies qui touchent 20 à 30% des individus au cours de leur vie, et dont l’incidence croît avec l'âge.mutations particulières du gène codant pour GPR50 ont une prédisposition1 et MT2 dans certaines formes de dépression chez l’homme. D’ailleurs, une nouvelle génération d’antidépresseurs ciblant ces récepteurs doit être bientôt mise sur le marché. Pour ouvrir de nouvelles perspectives dans ce domaine, nous sommes en train de caractériser ces récepteurs et leurs gènes en collaboration avec l’équipe du Prof MO Krebs à l’Hôpital St. Anne. De récentes découvertes montrent que les personnes présentant des aux dépressions majeures. Les fonctions de GPR50, qui restent à déterminer, pourraient donc expliquer le lien observé entre excès de mélatonine et épisodes dépressifs. De plus, des évidences pharmacologiques suggèrent un rôle clé des récepteurs MT

4 - Les MTR dans les maladies neuro-dégénératives

Les troubles du sommeil, les insomnies ainsi que d’autres perturbations du rythme circadien sont fréquemment retrouvés chez les patients âgés et d’autant plus chez ceux sévèrement atteints de la maladie d’Alzheimer. Ces troubles sont les principales raisons pour lesquelles ces patients atteints d’Alzheimer sont hospitalisés. Les taux de mélatonine diminuant au cours du vieillissement, en particulier dans les cas d’Alzheimer, l’administration de mélatonine est envisagée comme un traitement potentiel des troubles circadiens liés à cette pathologie. Nous nous intéressons plus particulièrement à la détection d’altérations potentielles des MTR chez les patients atteints de cette maladie. Grâce à l’utilisation d’anticorps développés par notre équipe et par l’équipe des Drs. F. Fraschini et D. Angeloni, nous avons caractérisé l’expression des MTR par immunohistochimie dans la rétine et diverses structures du cerveau.

Marquage vasculaire de MT1 (coloration rouge) dans l’hippocampe : Augmentation de l’immunoréactivité des récepteurs MT1 chez les patients atteints d’Alzheimer (AD) (Savaskan et al. Neuroscience Letters, 2001).

L’obésité est aujourd’hui considérée comme une menace majeure de santé publique,diabète de type II, maladiescancer…). L’obésité touche aujourd’hui 20 à 30 % de la population dans les pays industrialisés et ces chiffres devraient encore croître dans les années à venir. L’obésité est souvent liée à un déficit de sensibilité à une hormone, la leptine. La leptine est principalement sécrétée par le tissu adipeux blanc et agit au niveau du cerveau (noyau arqué de l’hypothalamus) pour réguler les dépenses énergétiques et la prise alimentaire. fréquemment et étroitement associée à des complications graves ( cardiovasculaires,

Pour propager son action, la leptine doit interagir et activer son récepteur (OB-R),mutations génétiquesCet état pathologique est appelé "résistance à la leptine".barrière hémato-encéphalique, soit d’un défaut de signalisation du récepteur ou d’une altération du nombre de récepteurs à la surface cellulaire. conduisant au déclenchement de multiples voies de signalisation (Jak2/STAT3, MAPK, PI3K, AMPK). Des altérant l’expression de la leptine ou de son récepteur, sont des causes d’obésité massive chez la souris et chez l’homme. Cependant, ces mutations sont très rares. Dans la majorité des cas, les malades obèses présentent paradoxalement des taux de leptine circulante élevés qui sont incapables d’induire une réponse adéquate. La résistance à la leptine peut être le résultat soit d’une déficience du transport de l’hormone à travers la

1 -  De nouveaux composés régulant l’activité du OB-R

En utilisant la technologie BRET, notre équipe a montré que l’OB-R est un oligomère préformé qui subit un changement de conformation suite à la liaison du ligand. En effet, on peut détecter une augmentation du signal BRET lors du changement de conformation du récepteur, où la luciférase fusionnée à l’un des protomères du récepteur transmet son énergie à la YFP fusionnée au second protomère.

Nous cherchons à identifier et caractériser de nouvelles moléculesDe tels composés pourront constituer de nouvelles solutions thérapeutiques puissantes notamment dans le traitement de la résistance à la leptine. Nous utilisons notre test de BRET qui a été adapté aux besoins des cribles à haut débit. capables d’intervenir au niveau de l’activation de l’OB-R. Des molécules qui activent l’OBR différemment de la leptine pourraient soit réactiver des récepteurs résistants à la leptine, soit potentialiser la réponse faible de la leptine par un mode d’action allostérique.


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Suivi de l’activation d’OB-R par BRET : (A) Description de la technique de BRET. (B) Effet de différentes drogues sur le signal de BRET. (C) Test de criblage de ligands interagissant avec OB-R basé sur la technique de BRET.

2 - Analyse moléculaire des modifications épigénétiques induites par une malnutrition précoce : effet sur le développement de maladies métaboliques chez l’adulte.

Dans les pays occidentaux, les maladies métaboliques (dérégulation de l’homéostasie glucidique, hypertension, maladies cardiovasculaires…) prennent des allures épidémiques et se développent de plus en plus à un âge très précoce. Des données épidémiologiques et expérimentales montrent que des « stimuli » nutritionnels très précoces (avant la naissance et pendant les premières années de la vie) conditionnent le développement de maladies métaboliques à l’âge adulte. Cette « programmation nutritionnelle »  peut être transmise d’une génération à l’autre. Il semble donc que des modifications épigénétiques soient impliquées dans ces processus de programmation précoce. Le but de notre projet est d’identifier, au niveau moléculaire, les mécanismes associés à la programmation nutritionnelle précoce et qui entraînent le développement de pathologies chroniques chez l’adulte.

Notre projet sera centré sur la méthylation de l’ADN, qui apparaît être un mécanisme clés pour la transmission des modifications épigénétique entre les générations.

OB-RGRP,récepteur de la leptine chez la souris, pourrait devenir une nouvelle cible pour le traitement de l’obésité régulateur négatif du

L’obésité est une préoccupation majeure de santé publique dans nos sociétés modernes. Elle est particulièrement liée au développement du diabète de type 2, des maladiesLe Mexique, par exemple, a atteint le deuxième rang mondial, après les Etats-Unis, avec presque 30% d’obèses et les soins médicaux engendrés par le surpoids absorbent déjà 21% du budget de la santé publique (l’obésité y est devenue la première cause de mortalité). cardio-vasculaires et à une augmentation du risque de développement cancéreux. En effet, environ 40% des Français sont concernés par un surpoids et plus que 12% sont obèses. Bien que le taux d’obésité ait déjà doublé en dix ans, ces chiffres devraient encore croître dans les années à venir.

Parmi les hormones-clés impliquées dans l'obésité et le maintien du poids corporel figure la leptine. Cette hormone est associée à la sensation de satiété et joue un rôle majeur dans le contrôle de la prise de poids et la dépense d’énergie. La leptine agit sur des récepteurs spécifiques (OB-R) exprimés au niveau des tissus périphériques et le système nerveux central, en particulier le noyauhypothalamus, la région-clé impliquée dans la régulation du poids corporel. Le taux sanguin de la leptine, qui est majoritairement sécrétée par les adipocytes, est proportionnel à la masse adipeuse. Chez les sujets normaux, des taux de leptine élevés conduisent à une augmentation de la dépense énergétique et à une diminution de la prise alimentaire, donc à une baisse de la masse adipeuse et du taux de la leptine. arqué de l’

En revanche, chez les personnes obèses, ce mécanisme de contrôle ne fonctionne plus et l’on parle d’une résistance à la leptine. La prévention de cette résistance constitue un enjeu majeur de la recherche sur l’obésité.

En 1997, notre laboratoire avait découvert que le gène codant pour le récepteur de la leptine (OB-R), la cible moléculaire de l’hormone, codait aussi un deuxième transcrit appelé OB-RGRP pour "OB-R gene related protein" (1). Mais ce n’est qu’en 2002 que l’équipe du Dr Rosine Haguenauer-Tsapis a montré que Vps55p, l’homologue d’OB-RGRP chez la levure, régulait le transport des protéines entre le Golgi et la vacuole (2). Inspiré par ce travail pionnier, nous avons fait l’hypothèse qu’OB-RGRP pourrait remplir une fonction similaire chez l’homme et plus spécifiquement sur OB-R à cause de leur lien génétique. Le travail (3) montre, chez la souris, qu’OB-RGRP règle le transport intracellulaire d’OB-R et que l’inhibition de son expression augmente de façon significative le nombre des récepteurs de la leptine présents à la surface cellulaire et, ainsi la sensibilité de la cellule à cette hormone.

Nous avons appliqué cette observation à un modèle murin d’obésité induite par une nourriture riche en graisse dans lequel une résistance à la leptine s’instaure progressivement. L’extinction de l’expression du gène OB-RGRP par des ARNLes ARN interférents, dont la découverte a été couronnée par le Prix Nobel de Physiologie et Médecine 2006, sont de petits fragments d’acides nucléiques capables d’éteindre l’activité de gènes spécifiques. interférents permet aux souris traitées de maintenir, contrairement aux témoins, un poids tout à fait normal.

Ce travail ouvre plusieurs perspectives pour le traitement de l’obésité. Il identifie OB-RGRP comme une nouvelle cible, et propose un nouveau concept thérapeutique. En d’autres termes, au lieu d’utiliser une molécule agissant sur le récepteur lui-même, on pourrait supprimer le tonus inhibiteur d’un partenaire de régulation. Des applications thérapeutiques concrètes peuvent aussi, à terme, être envisagées  pour le traitement de l’obésité et des maladies associées, tel le diabète de type 2. Si les résultats obtenus chez la souris s’avéraient transposables à l’homme, l’inhibition de la protéine OB-RGRP (soit par des ARN interférents, soit par des antagonistes pharmacologiques) pourrait alors permettre de restaurer la sensibilité à la leptine des sujets obèses, et contribuer durablement à leur perte de poids.

 

 

 

 

 






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