L’arbre phylogénétique des procaryotes donne deux groupes :
- Les eubactéries ou bactéries vraies.
- Les archéobactéries, qui vivent en conditions extrêmes.
On va surtout s’intéresser aux eubactéries et en particulier, à Escherichia coli (Gram -, entérobactérie vivant dans notre intestin).L’intérêt de la génétique procaryote : actuellement, on a identifié moins de 1% des bactéries vivantes, il y aurait 5.1030 bactéries au total. Dans les océans, il y a 106 bactéries par mL d’eau de mer. On ne sait cultiver qu’un petit nombre de ces bactéries, on ne sait donc pas identifier les autres.
Les bactéries sont :
- responsables de maladies,
- utilisées en biotechnologie,
- des organismes « simples », faciles à étudier.

I Le cycle cellulaire de E. coli.

La dimension d’E. coli varie en fonction du milieu de culture : si le milieu est riche, la bactérie sera plus grosse.
E. coli se multiplie par scissiparité.
T est le temps de génération (au mieux, 20 minutes).
Pour se multiplier pendant la période ?, la longueur va être multiplier par 2 et le diamètre va varier. A la fin de cette période (T), on obtient deux cellules filles par division qui ont la longueur initiale.Dans la bactérie, l’ADN met 40 minutes pour se répliquer : c’est la période C (constante). Il faut 20 minutes entre la fin de la réplication et la division : c’est la période D (constante).
Comment T=20 minutes est possible alors que 40minutes+20minutes=60minutes=constante?
Concept : I+C+D ; I est le temps nécessaire à la cellule pour se préparer à une nouvelle initiation de réplication. En général, I=T. La division cellulaire est instantanée (pas de temps de mitose).
Dans la cellule mère, il y a plusieurs cycles de réplication en même temps, donc la période I d’un cycle peut avoir lieu dans une bactérie arrière-grand-mère.
Une bactérie peut croître en milieu liquide ou en milieu solide. Les bactéries sont conservées en laboratoire dans des congélateurs à –70°C et à 15% de glycérol pour éviter l’éclatement.Pour faire pousser, on prend un peu de culture en réserve que l’on met dans un milieu de culture à 37°C et on agite Mesure de culture.

• La phase de latence.
Cette phase correspond au temps nécessaire à la bactérie pour s’adapter à son nouveau milieu pour pouvoir se diviser activement. • La phase exponentielle.
Toutes les bactéries poussent avec le même ? mais toutes les bactéries ne sont pas synchronisées. En anglais, on dit « steady state » (état d’équilibre). Quelque soit le moment de la phase exponentielle, pour tous les paramètres, la concentration ne variera pas : on a un équilibre entre les voies de synthèse et de dégradation. En steady state, on dit que les bactéries sont « physiologiques ». On travaille toujours avec ce type de bactéries. • La phase stationnaire.
Les bactéries ne poussent plus car il n’y a plus rien à « manger » ? ce sont elles que l’on stocke. Ce sont les facteurs environnement et trophique qui limitent la croissance d’une culture de bactéries. Une bactérie se prépare à la phase stationnaire car elle a des capteurs : elle accumule du stock, elle se fait une membrane plus épaisse et ne synthétise que les protéines réellement utiles.

Pour construire une courbe de croissance bactérienne, on mesure le nombre de cellules par mL par spectrométrie car il existe une relation entre DO et nombre de cellules par mL.
DO = 1 4.10^8 cellules/mL.
Pour savoir si les bactéries sont mortes ou vivantes, on étale l’échantillon sur un milieu de croissance à différentes dilutions. On fait ensuite la DO des seules bactéries qui ont poussé.
Pour un diamètre de 1mm, on a 10^7 cellules par colonie, soit, 23 générations.
N = N0 x 2^t/Z et N = d² x 10^7
N est le nombre de bactéries, N0 est le nombre initial de bactéries, d est le diamètre.

 

II Le génome bactérien.

A Le génome chromosomique.

L’ADN de E. coli est formé d’ADN double brin circulaire, d’une origine C, d’un terminus C et fonctionne en réplication en mode bidirectionnelle : l’initiation commence en ori C, il y a ensuite séparation des deux brins et allongement du brin complémentaire par une polymérase.

L’ADN a été séquencé dans la souche sauvage de référence MG16SS et pèse 4936kpb. On peut connaître le nombre de plages ouvertes de lecture (ORF) afin de connaître le nombre de gènes (à peu près 5000 gènes).

Sur une population bactérienne, il y a toujours moins de 0,1% de particules sans ADN, donc, la partition du chromosome entre les deux cellules filles est régulée.

Le génome minimal est le nombre minimal de gènes nécessaires à la vie (250 gènes pour E. coli). Les gènes nécessaires à la vie sont toujours très conservés. Pour E. coli, 100 gènes servent à la traduction et 28 ont un rôle inconnu.

B Le génome extra chromosomique : plasmide, virus et transposons (Elts genetic Mobils).

 

Gène et mutation.

 

I Le gène.

Définitions :
- Selon Mendel : Le gène est l’unité structurale et fonctionnelle de l’hérédité, porteuse de l’information d’une génération à l’autre. Cette définition est basée expérimentalement sur l’expérience de la complémentation.
- Le gène est un segment d’ADN qui spécifie un polypeptide ou un ARN actif. On exclu les séquences consensus. C’est la définition minimaliste de Watson.

Dans une bactérie, les gènes sont souvent organisés en un même opéron s’ils sont impliqués dans une même fonction.

Nomenclature : par exemple, l’arginine peut être écrite argA ; soit, trois lettres en minuscules et une lettre en majuscule et le tout est souligné.
Si l’on a plusieurs allèles, on ajoute le numéro de l’allèle : argA1. Le gène argA code pour la protéine ArgA : une lettre majuscule, deux lettres minuscules et une lettre majuscule ; rien n’est souligné.

 

II Recherche des mutants.

Toute analyse génétique débute par l’isolement d’un mutant. On identifie ensuite le gène muté.
On peut aussi prendre un gène, le faire muter, le « remettre » dans la cellule et comprendre son rôle : c’est de la génétique inverse.

A définitions.

• Mutation : c’est le changement héréditaire dans la séquence nucléotidique qui ne se traduit pas forcément par un phénotype observable.
• Mutant : un mutant est un organisme ou une cellule qui porte une mutation (pas forcément observable).
  En pratique, on parle de mutant quand celui-ci présente un phénotype différent de celui du sauvage et on considère que le nombre de mutants est égale au nombre de mutations.

• Fréquence de mutants : c’est le nombre de cellules mutantes sur le nombre total de bactéries.
• Taux de mutation : c’est la probabilité qu’un événement mutationnel se produise en un laps de temps donné. Le taux de mutation est obtenu en mesurant la fréquence de mutant par unité de temps choisi.

  B Différents types de mutants et les stratégies d’isolement (repérage et isolement).

Une souche auxotrophe est incapable de synthétiser un constituant cellulaire.
Une souche prototrophe est capable de synthétiser tous ses constituants cellulaires sur un milieu minimum (eau, sels minéraux, sucre).

Les mutants de sucre : ces mutants sont incapables de d’utilisr un sucre donné comme source d’énergie (C et N).
Les mutants de résistance (à un composé toxique) : c’est un mutant qui pousse même en présence d’un composé toxique.
Les mutants de fonctions essentielles ou Mutants conditionnels : en conditions permissives, la mutation ne s’exprime pas et la bactérie pousse. En conditions non permissives, la mutation s’exprime et la bactérie meure. On trouve dans ce cas, les mutants thermosensibles. Ce sont des mutations qui changent un acide aminé, donc il y a variation dans la structure tridimensionnelle de la protéine.

Isolement :
- Mutant de résistance : sélection.
- Mutant auxotrophe : repérage.
- Mutant de sucre : repérage.
- Mutant conditionnel : repérage.

1 Sélection.

Si la fréquence de mutation de résistance à l’ampicilline est de 10-9, on fait une structure d’au moins 109 cellules ; on centrifuge puis n étale sur une boite contenant de l’ampicilline. Sur les 109 cellules, une seule poussera ? La souche est isolée.

2 Repérage.

Repérage de mutants d’auxotrophie, de sucre et conditionnels.
Si la fréquence Arg résistance est égale à 10-6, on étale sur une première boite de milieu complet : tout pousse.
On repique ensuite sur une seconde boite sans arginine et l’on regarde ce qui ne pousse pas et par corrélation avec la boite 1, on repère la souche.
Pour espérer repére un mutant, on doit faire un million de boites !!! Pour diminuer le nombre de boites, on peut augmenter la fréquence de mutation par mutagenèse.

 

III Mutation spontanée – Nature des mutations – Suppression.

On a deux hypothèses quant à l’apparition des mutations :
- Au hasard : ce sont des mutations spontanées ou directes.
- Pour s’adapter : on parle dans ce cas de mutations adaptatives.

A Expérience de démonstration (Lederberg 1952).

On prend des échantillons mutants déterminés par l’expérience I sur le tapis cellulaire et l’on recommence autant d’expériences que d’échantillons.
Si l’on obtient la même fréquence de mutation qu’en I, la mutation est dite adaptative.
Si la fréquence augmente à chaque expérimentation, on parle alors de mutations spontanées.
On note que si la fréquence augmente jusqu’à 100% pour de nombreux cycles, c’est que l’on est en présence de mutation spontanée indépendante de l’agent sélectif (c’est un dogme).

B Nature des mutations.

1 Mutations ponctuelles.

Les mutations ponctuelles concernent un seul nucléotide. Il existe différents types de mutations ponctuelles :
- Conservatives.
- Faux sens.
- Non sens.
- Décalantes.

Mutation conservative : cette mutation ne modifie pas l’acide aminé intégré dans la chaine polypeptidique. En effet, le code génétique est dégénéré.
Mutation faux sens : cette mutation entraîne l’incorporation d’un mauvais acide aminé dans la chaine polypeptidique. Si cet acide aminé est important, on obtient un phénotype mutant.
Mutation non sens : il y a remplacement d’un nucléotide par un autre et engendre ainsi un codon stop. C’est aussi un cas d’apparition de phénotype mutant.
Mutation décalante : il s’agit ici de la délétion ou de l’insertion d’un nucléotide qui décale le cadre de lecture. Il y a souvent engendrement d’une mutation faux sens et apparition d’un peptide incorrect et donc un phénotype mutant.

2 Remaniements génétiques.

Les remaniements génétiques concernent diverses centaines de nucléotides. Il existe différents types de remaniements :
- inversion – délétion – duplication : ces trois phénomènes impliquent un processus de recombinaison homologue.

a Délétion.

 

On a délété la séquence entre B et C : on obtient alors

b Inversion.

Ces remaniements permettent, au cours de l’évolution, de faire évoluer les gènes essentiels.

c Les séquences homologues.

EGM : Element Genetic Mobil ; IS : Insertion sequence ; Tn : Transposon.
• IS : c’est un fragment d’à peu près 700pb. On trouve plusieurs copies de IS sur le chromosome. Ce sont des séquences qui permettent des recombinaisons homologues.

La transposase et les séquences répétées sont nécessaires à la transposition.

• Tn : le transposon est un élément composite constitué de deux IS en répétition inversée, encadrant un morceau d’ADN portant un gène de résistance ç un antibiotique. Le fragment fait plusieurs Kb.

Le transposon « transpose » car IS contient la transposase et les séquences aux extrémités des IS. Le gène entre les IS n’intervient pas.
Tout peut être transposé, soit, seulement un IS, soit, tout le chromosome ( Transposition inverse) à l’extérieur des IS On a soit Tn, soit le chromosome, soit un IS qui transpose.

3 Suppression.

Une seconde mutation va supprimer l’effet de la première. Une seconde mutation intragénique se situe dans le même gène que la première. Une seconde mutation extragénique se déroule dans un autre gène que la première.

Les mutations intragéniques sont rares. Elles suppriment les mutations non sens, faux sens et décalantes.

Les mutations extragéniques peuvent être :
- Indirectes.
Ces mutations permettent d’identifier les différents partenaires d’un même processus de biosynthèse. Exemple du métabolisme du glucose :
Galactose (GalK) Galactose-1P (GalE) UDP-Glucose.
• Si tout va bien, on obtient du glucose.
• S’il y a mutation de GalE, il y aura accumulation de Galactose-1P toxique, donc, mort de l’individu.
• Si la mutation a lieu sur GalK, on observe une accumulation de galactose, non toxique. Il y a mise en évidence d’un nouveau gène GalK qui appartient à la chaine du métabolisme.

- Directes informationnelles : elles concernent les gènes des ARNt.
La seconde mutation a lieu dans le gène de l’ARNt et implique la mutation de l’anticodon de cet ARN. Ce nouvel ARNt va pouvoir insérer un acide aminé dans la chaine polypeptidique, même s’il lit un codon stop, la chaine continue.
Exemple de mutation :
• Mutation supE : elle inclut Glu en face du codon stop AMBRE (UAG).
• Mutation supF : elle inclut Tyr en face du codon AMBRE.
• Mutation supL : elle inclut Lys en face das codons AMBRE et OCHRE (UGA).
• Remarques : AMBREUAG ; OCHREUGA ; OPALEUAA.

- Indirect informationnelles : elles concernent les gènes impliqués dans la traduction des ARNm en affectant l’efficacité.

C Nature des mutations.

1 Fidélité de la réplication.

Les mutations apparaissent essentiellement au moment de la réplication. Cette mutation va être fixée au cycle de réplication suivant.
Si, pendant la réplication, il y a erreur, la cellule peut réaliser une correction. Cela explique pourquoi, in vivo, le taux de mutation est très faible.

2 Modification de base.

La modification de base se déroule après la réplication.
Par exemple, une cytosine qui perd son NH2 devient une tyrosine. La mutation sera fixée par la réplication.

3 Réarrangements.

Les réarrangements ont lieu pendant la synthèse ou après la réplication. Ce sont des phénomènes très rares.

 

IV Mutagenèse.

On peut réaliser une mutagenèse par des agents chimiques (NitrosoGuanidine), par des agents physiques (UV qui créent des dimères de T), avec des transposons (très pratique).
On augmente la fréquence de transposition en accroissant l’expression de la transposase. Si la transposition porte un gène de plasmide juste à coté d’un gène chromosomique, cela les lie. Les deux phénotypes seront toujours retrouvés ensemble. Si un des deux gènes n’est pas sélectionnable et qu’on le lie à un gène sélectionnable, cela le fait passer d’une situation de repérage à une situation de sélection C’est un avantage.
Comme inconvénient, on ne pourra pas isoler de mutant de ce genre essentiel car, quand un transposon entre dans un gène, il l’inactive.

Mutagenèse dirigée.

Pour transférer, un ADN doit s’insérer dans un réplicon pour une recombinaison homologue (dépend de la protéine RecA).
Réplicon : chromosome ou plasmide selon qu’il y ait homologie ou non. Lors de la recombinaison, le produit entrant sera répliqué, le produit sortant sera perdu car il sera seul dans le cytoplasme et donc détruit par la nucléase.

I La conjugaison.La conjugaison est processus par lequel un ADN est transféré d’un bactérie donneuse à une bactérie réceptrice. Il faut qu’il y ait un contact physique.
La capacité d’une bactérie à donner son ADN dépend de la présence du plasmide F (facteur de fertilité).
Le plasmide F est composé de 100Kb, est présent en une seule copie par bactérie et est extrêmement stable, donc jamais perdu pour la population, car il a développé des systèmes :
- Système de Partition : il va se répartir pareillement dans les deux cellules filles.
- Système de Killing : si le système de partition ne fonctionne pas et qu’une cellule fille ne porte pas ce plasmide, elle sera tuée.Le facteur F peut s’intégrer au chromosome bactérien (avec une fréquence de 10-4). Comme F peut être intra ou extra chromosomique, on le nomme « épisome ». Ce facteur s’intègre par recombinaison homologue, car il possède des : -IS2 -IS3 –Transposons. Il possède aussi des gènes tra, nécessaires au mécanisme de transfert de la conjugaison (1/3 du génome de F), une origine de transfert –OriT- et bien sûr, une ou plusieurs origines de réplication.tra code pour le pili sexuels qui ont pour rôle d’aller chercher un partenaire. Un individu avec pili est dit : mâle ou F+ ; un individu sans pili est dit femelle ou F-.
Pour que la conjugaison soit possible, il faut F+ et F-.
Les pili, en se dépolymérisant, vont rapprocher les partenaires ? contact.
Une fois le contact réalisé, F de F+ passe progressivement vers F- à partir d’OriT. Ce qui entre en premier est le bout 5’.
F- devient F+
F+ reste F+ car au fur et à mùesure que F passe dans F-, il est répliqué.La conjugaison est rapide : autour de deux minutes. Le facteur F est un réplicon donc, tout se fait extrachromosomiquement.Quand F vient s’intégrer au chromosome bactérien, la bactérie devient HFr. La recombinaison de F est alors prise en charge par la réplication du chromosome (bactérien). F peut se ré-exciser à la fréquence de 10-4.
Si F s’excise en utilisant la séquence IS1, il y a erreur, normalement, c’est avec IS2.

Alors, le produit de l’excision comportera un bout de chromosome bactérien on parle alors du « facteur F’ ».
F’ peut conjuguer comme une bactérie F+.
F’ F- :
F- devient F’ et donc, on parle de diploïdie partielle pour le bout de chromosome bactérien contenu dans le plasmide et dans le chromosome de la nouvelle F’. Cela permet des expériences de complémentation. C’est intéressant d’un point de vue évolutif.Remarque : A l’arrivée de toutes ces conjugaisons, on n’aura plus que des « mâles ». Pour lutter contre ce phénomène, on prend Hfr comme bactérie donneuse Hfr x F-.

Lors de la conjugaison, avec le plasmide intégré, vont passer A, B, C… Donc, dans F-, il peut y avoir recombinaison homologue.

F- (a) deviendra F-(A) car tout le plasmide ne pénètre pas (il manque la fin).
La conjugaison s’arrête spontanément et au hasard, donc, la probabilité pour qu’un marqueur passe dans la souche réceptrice dépend de la position de celui-ci par rapport à OriT : plus le marqueur est proche d’OriT, plus il a de chances de passer ? C’est le gradient de transfert.

C’est grâce à ses expériences de recombinaison que l’on a su que le chromosome de E. coli était circulaire avant même de savoir réellement que c’était un chromosome.
En conjugaison, on travaille sur de grandes parties de chromosomes.

Applications :
- Transformer une bactérie leu- en leu+ par une souche donneuse leu+ Hfr.
- Mutagenèse régionnalisée toujours avec Hfr.

 

II Transduction.

Il faut un vecteur (e) donneur et un récepteur. Ce vecteur va être un phage. Il existe deux types de transduction :
- Spécialisée avec le phage . C’est toujours la même région d’ADN de cellule donneuse qui est transductée.
- Généralisée avec le phage P1. N’importe quel bout d’ADN peut être trasnsducté.

Les phages injectent leur ADN dans les bactéries. Cet ADN se circularise puis peut avoir deux avenirs possibles car et P1 sont des phages tempérés :
- Le cycle lytique : la réplication du génome phagique est très efficace et tous les gènes sont exprimés. Finalement, il y a lyse des bactéries et libération de 100 à 500 phages.
- Le cycle lysogénique : l’ADN injecté dans la bactérie ne se réplique pas. A partir de là, on distingue deux cas (un pour et un pour P1) :
• Pour : l’ADN non-répliqué s’insère sur le chromosome bactérien au locus attB (entre les gènes bio et gal). On a alors un prophage qui n’exprime qu’un gène : celui de rester intégré. Sa réplication est prise en charge par le métabolisme bactérien.
• Pour P1 : l’ADN non-intégré se circularise et reste extra-chromosomique, mais on parle aussi de prophage. Il va se comporter comme un plasmide. C’est un réplicon qui se suffit à lui même et possède un système de partition et de killing.

Les prophages et P1 peuvent naturellement entrer en cycle lytique. P1 donne alors directement des phages alors que doit d’abord s’exciser.

Lors de l’encapsidation, au lieu d’encapsider du génome phagique, le phage P1 encapside de l’ADN chromosomique (dans 0,3% des cas). Ces particules phagiques qui contiennent de l’ADN chromosomique sont tranductrices. Chaque région du chromosome a la même probabilité d’être encapsidée dans la particule phagique C’est la transduction généralisée.
Lors de l’excision du phage , il peut y avoir des problèmes : l’excision contient un bout de bio ou de gal. Lors de l’encapsidation, bio ou gal va l’être aussi c’est la transduction spécialisée.

Applications.

Un phage P1 virulent entre systématiquement en cycle lytique.
On va réaliser un étalement des bactéries sur une boite. On y dépose ensuite un phage P1 virulent ; il entre dans une bactérie, s’y multiplie et produit 100 à 500 nouveaux phages. Ces derniers vont infecter d’autres bactéries.
Remarque : Une bactérie lysogène devient immune, c’est à dire, insensible à une surinfection.

au final, on observera une plage de lyse claire : une plage de phage introduits.
Si l’on avait utilisé un phage P1 sauvage, celui-ci aurait pu entrer en cycle lytique ou en cycle lysogénique. Donc, dans la plage de lyse finale, il reste des bactéries lysogènes qui continuent à se multiplier : on a alors une plage de lyse trouble.

Avec P1 :
Dans 90% des cas, un fragment d’ADN transduit est détruit par les nucléases. Dans les 10% restant, s’il peut y avoir une recombinaison homologue, le fragment est inséré dans le chromosome de la bactérie réceptrice qui prendra ce nouveau caractère et perdra son ancien caractère car on est toujours en situation d’haploïdie

Applications :
- Mutagenèse régionnalisée.
- Cartographie
En transduction de ce type, on travaille sur de petites portions de chromosome : jusqu’à deux minutes, soit 90Kb.

On peut affiner une cartographie en localisant la mutation par rapport à un marqueur connu.
Si l’on réalise la transduction d’une bactérie m+, leu- par une bactérie m-, leu+ et que l’on sélectionne les bactéries leu+, on pourra obtenir deux cas de figure :
- Ces bactéries sont leu+, m- : on a cotransduit les marqueurs leu et m. ? m est à moins de deux minutes du marqueur leu.
- Ces bactéries sont leu+, m+ : on n’a pas cotransduit leu et m. donc m est à plus de 2 minutes de leu.

Si l’on est à moins de deux minutes (leu et m), on peut calculer la fréquence de cotransduction qui est absolument corrélée à la distance (e) leu et m.

 

Cette corrélation suit la loi de wu
F=(1-d/l)^3
D est la distance (e) 2 marqueurs.
L : distance maximum (e)
2 : marqueurs c’est à dire, 2 minutes ou 90Kb.

 

III La transformation.

Capture d’ADN exogène par une bactérie dite compétente.
Certaines bactéries sont compétentes naturellement. Elles récupèrent l’ADN double brin. Elles dégradent un bbrin et intègre l’autre grâce à l’énergie due à la dégradation du premlier brin. Ensuite, il y a recombinaison homologue.
E. coli n’est pas compétente mais on peut la rendre compétente par un choc électrique. Ce qui enbtre est double brin :
- s’il est linéaire, il est détruit.
- Si c’est un plasmide, il est intégré.
L’intérêt du plasmide peut porter :
- sur le phénomè-ne de résistance.
- Peut être un vecteur de clonage.
- Peut muter un gène.

Un plasmide porter souvent un gène de résistance, donc, pour sélectionner une bactérie transformée, on la fait pousser sur un milieu plus antibiotique spécifique : méthode peut efficace.